Technische Universiteit Delft

Alle promoties, intree- en afscheidsredes worden gehouden in de Aula van de TU Delft, Mekelweg 5, Delft

Promotie

Biokatalyse
5 juni 2002 | 10.30 uur
hr. A.V. Cherepanov | Novosibirsk State U. Rusland
promotoren | Prof.dr. S. de Vries en prof.dr. W.R. Hagen (fac TNW)

TY DNA ligase: mechanism of catalysis, substrate specificity and application to a novel method of scanning mutagenesis
In dit proefschrift worden de substraatspecificiteit en het mechanisme van katalyse onderzocht van de ATP afhankelijke DNA ligase van de bacteriofaag T4. Eén van de conclusies luidt dat de specifieke details van de katalyse levende organismen een bescherming bieden tegen de ophoping van ongewenste mutaties. Tevens zijn de resultaten direct toegepast in een nieuwe mutagenese strategie. Hiermee is het mogelijk om in één enkele stap een bibliotheek te vervaardigen waarin alle mogelijke enkelvoudige aminozuurmutaties van een eiwit zijn vertegenwoordigd.
Wat de fundamentele enzymologie van DNA ligases betreft, zijn de volgende onderwerpen diepgaand bestudeerd: a) het mechanisme waarmee een enkelstrengsbreuk in dsDNA wordt herkend en waarvoor wordt voorgesteld dat een B-naar-A DNA helix conformatieverandering een belangrijke rol speelt; b) het mechanisme van de nucleotidyl-overdracht via een twee-magnesium ion mechanisme met een pentagecoördineerd fosforaan-atoom als intermediair; c) een vergelijking van de structuur van DNA en RNA ligase met die van andere nucleotidyltransferasen waaruit het bestaan van een gemeenschappelijke eiwitvouwingsstructuur aannemelijk wordt gemaakt die direct verantwoordelijk is voor katalyse en d) de substraatspecificiteit in het bijzonder die van niet-complementaire nucleotiden.
T4 DNA ligase wordt toegepast in een nieuw 'saturation scanning mutagenesis' (SSM) protocol als het sleutelenzym dat trinucleotide mismatches aanbrengt in dsDNA. Het SSM protocol zoals in dit proefschrift is ontwikkeld bestaat uit drie belangrijke stappen: 1) Bereiding van een verzameling megaprimers volgens het nieuwe principe van "reversibele ketenverlenging". Hierin wordt dsDNA gesequenced met ddNTP's waarna de 3'-ddNMP's worden verwijderd met Exonuclease III. 2) Ligatie van mutagene oligonucleotiden aan de megaprimers door T4 DNA ligase. De gebruikte mutagene oligonucleotiden bevatten een trinucleotide mismatch, een 6-meer, 4096-voudig, ontaarde bindingsplaats en fosfaatgroepen aan zowel de 3'- en de 5'-uiteinden. 3) Verlenging van de ligatieproducten door DNA polymerase hetgeen resulteert in een kloonbank die bestaat uit het oorspronkelijke wilde type en alle mogelijke enkelvoudige aminozuurmutaties.

Voor verder lezen:

* Molecular and cellular mechanisms of mutagenesis, symposium, Gatlinburg, Apr. 1981

* Site-directed mutagenesis and protein engineering, 1991
* DNA replication and mutagenesis, by Moses, Robb E., 1988
Maarten van der Sanden
Wetenschapsvoorlichter
Communicatie & Marketing Groep / TU Delft
tel.: 015 2785454
fax.: 015 2781855
GSM: 06 20408176

Zoekwoorden:

Deel: ' Promotie onderzoek substraatspecificiteit en mechanisme katalyse '




Lees ook